山东省烟台市2022-2023高二下学期期中考试生物学试题（解析版）

烟台市2022-2023学年高二下学期期中考试
生物
注意事项：
1．答题前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。回答非选择题时，将答案写在答题卡上。写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求。
1. 下列有关传统发酵技术的描述，错误的是（　　）
A. 传统发酵技术所用的菌种一般是原料中天然存在的微生物
B. 传统发酵技术是微生物在有氧或无氧条件下物质的氧化分解
C. 传统发酵技术的目的是获得发酵产品或更多的微生物
D. 果酒、果醋、泡菜、酱油等是传统发酵技术的产物
2. 啤酒是以大麦为主要原料，经酿酒酵母发酵制得。啤酒的工业化生产分为主发酵和后发酵两个阶段。精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒不同，不添加食品添加剂，不进行过滤消毒处理。下列叙述正确的是（　　）
A. 利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B. 啤酒的工业化生产过程中，酒精的产生积累主要在主发酵阶段完成
C. 后发酵阶段会因pH或酒精含量升高而终止发酵
D. 精酿啤酒不进行过滤和消毒，故发酵过程不需要在无菌条件下进行
3. 有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养，下图所示为操作流程。有关叙述错误的是（　　）
A. 在称取土壤、稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作
B. 用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需要进行灭菌处理
C. 步骤③中，将温度约50℃的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养
D. 步骤④中，划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
4. 由于发酵工程生产条件温和、原料来源丰富、价格低廉等，在许多领域得到了广泛的应用。下列有关发酵工程在食品工业上应用的叙述，错误的是（　　）
A. 利用黑曲霉发酵制得的柠檬酸，广泛用于调节食品的酸度
B. 利用谷氨酸棒状杆菌发酵得到谷氨酸，经一系列处理制成味精
C. 利用乳酸菌在青贮饲料中乳酸发酵产生有机酸而实现饲料保鲜
D. 利用发酵工程从微生物细胞中提取单细胞蛋白制成微生物饲料
5. 草莓是无性繁殖的作物，它感染的病毒很容易传播给后代。病毒在草莓体内逐年积累，会导致产量降低，品质变差。下图是育种工作者选育高品质草莓的流程图。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 方法一中，甲常选用茎尖，原因是其几乎未感染病毒
B. A、C两个过程属于植物组织培养，都经过脱分化和再分化
C. 通常采用70%的酒精和5%次氯酸钠溶液对甲进行消毒处理
D. 判断两种选育方法的效果都需要通过病毒接种实验
6. 随着植物花药培养以及植物体细胞杂交技术等得以确立和发展，标志着植物细胞工程技术进入了高速发展的阶段。花粉原生质体具备单倍体的优点，可直接与体细胞原生质体融合，实现配子与体细胞杂交。下列叙述错误的是（　　）
A. 花粉可培育成单倍体植株，是细胞全能性的体现
B. 用低渗溶液配制纤维素酶和果胶酶溶液制备原生质体
C. 利用植物组织培养技术将融合细胞培育成完整植株
D. 配子与体细胞杂交能缩短三倍体无子果实培育年限
7. 胚胎干细胞存在于哺乳动物的早期胚胎中，具有自我更新能力，在科学和医学领域具有极高的研究价值。早期胚胎干细胞的发育和自我更新受多个基因调控（如图）。下列叙述错误的是（　　）
A. 早期胚胎干细胞可分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞
B. Nanog基因突变可能使胚胎干细胞自我更新受阻
C. 促进Stat3和Oct3/4的表达会促进胚胎干细胞向滋养层分化
D. 将干细胞用于疾病的临床治疗可能存在导致肿瘤发生的风险
8. 科学家将大熊猫的体细胞和兔子的去核卵母细胞构建成重组细胞，使重组细胞成功发育为囊胚，标志着异种核质相容问题得到解决，异种克隆大熊猫迈过了第一道“坎”。下列说法错误的是（　　）
A. 获取卵母细胞前，用含促性腺激素的饲料饲喂兔子可使其超数排卵
B. 可通过梯度离心法去除兔子卵母细胞中的细胞核
C. 可将大熊猫的体细胞直接注入兔子的去核卵母细胞
D. 选用的去核卵母细胞中的细胞质已成熟，可支持重组细胞发育成胚胎
9. 将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合形成抗体-药物偶联物（ADC），可实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。下列叙述错误的是（　　）
A. 制备单克隆抗体应用的技术主要是动物细胞培养和动物细胞融合
B. 制备单克隆抗体时，至少需经过两次筛选才能得到分泌所需抗体的杂交瘤细胞
C. ADC与肿瘤细胞表面的抗原结合后，以胞吞的方式进入肿瘤细胞
D. ADC中的单克隆抗体起导向作用，能特异性结合并杀伤肿瘤细胞
10. 下列有关哺乳动物精子和卵子的发生及受精作用的叙述，错误的是（　　）
A. 雌性动物排出成熟卵细胞的过程即为排卵
B. 精子入卵后，卵子被激活才能完成减数分裂Ⅱ
C. 防止多精入卵的屏障是透明带反应和卵细胞膜反应
D. 受精的实质是精子形成的雄原核和卵子形成的雌原核的融合
11. 临床研究证明，全胚冷冻后的单囊胚移植能显著提高胚胎着床率、妊娠率及活产率，以及单胎新生儿的出生体重。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 囊胚的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织
B. 选择囊胚期进行胚胎移植的原因是该时期细胞还未分化
C. 通过胚胎分割技术可以获得基因型相同的双胞胎
D. 冷冻后再开展胚胎移植可能消除胚胎新鲜时移植存在的不利于胚胎着床的因素
12. 下表所示为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是（　　）
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 注：Y=C或T，R=A或C
BglII A↓GATCT KpnI CCTAC↓C
EcoRI G↓AATTC MbooI ↓GATC
HindI GTY↓RAC SmaI CCC↓GGG
A. 限制酶的作用底物都是双链DNA，都能切开磷酸二酯键
B. BglⅡ和MbooI两种限制酶切后可形成相同的黏性末端
C. SmaI切DNA后成的末端可用Ecoli DNA连接酶连接
D. 一种限制酶可能识别多种核苷酸序列
13. 天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延级药效。科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（　　）
A. 设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始
B. 该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造
C. 速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则
D. 该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素
14. 某研究小组利用鸡血细胞进行”DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述错误的是（　　）
A. 可用蒸馏水使细胞吸水涨破，释放DNA
B. 可用95%冷酒精溶解过滤后留在纱布上的DNA
C. 使用玻璃棒时应沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整
D. 将丝状物加入2mol/L的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后出现蓝色
15. RT-PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是（　　）
A. PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+
B. 一般情况下，引物A和B的长度越长C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越低
C. PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色
D. 实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
二、选择题：本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
16. 抗生素I-IV均可治疗黄色葡萄球菌（Sau）引起肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者将分别含等剂量抗生素的四张大小相同的滤纸片置于Sau均匀分布的平板培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 配制培养基时应将培养基的pH调至微酸性
B. 测量菌落和抑菌圈直径时应直接在皿盖上测量
C. 抗生素IV治疗Sau感染引起的肺炎效果最好
D. 抑菌圈中出现的菌落可能是Sau发生了基因突变
17. 植物细胞工程技术包括植物组织培养技术和体细胞杂交技术，在快速繁殖、农作物育种及提高农作物产量等方面具有广泛应用。下列有关说法错误的是（　　）
A. 可以利用植物组织培养脱分化所得到的胚状体等为材料制备人工种子
B. 由茎尖细胞形成愈伤组织过程中，可能会发生基因突变和基因重组
C. 进行植物体细胞杂交的实验，不必考虑亲本细胞的生殖隔离问题
D. 利用灭活的病毒能诱导植物原生质体融合的原理是细胞膜具有流动性
18. 研究发现；细胞膜上的转铁蛋白受体（TfR）与转铁蛋白（Tf）结合，可将铁元素运输至胞内。肿瘤细胞内铁元素浓度远高于正常细胞。科学家利用单克隆抗体技术，研制出鼠源性抗TfR抗体，可用于治疗小鼠肿瘤。下列说法错误的是（　　）
A. 肿瘤细胞表面TfR表达量多于正常细胞
B. 抗TfR抗体通过阻止Tf与TfR的结合来抑制铁元素的摄取，抑制肿瘤细胞增长
C. 制备单克隆抗体时需给小鼠接种TfR，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
D. 经特定选择培养基筛选出的杂交瘤细胞可直接注射到小鼠腹腔内增殖
19. 繁育“试管动物”时，合成培养液与共同培养体系被广泛用于早期胚胎的体外培养。共同培养体系是将受精卵和体细胞在体外共同培养，利用体细胞分泌的未知的分泌物来促进胚胎的发育。培养时，将体细胞处理后铺成单层细胞，作为胚胎发育的滋养层。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理
B. 合成培养液中通常要加入血清，还要定期更换
C. 共同培养体系能模拟体内环境，使细胞间能沟通信息，相互支撑
D. 代孕母畜可以是同种的或不同物种的，需对供体和受体进行同期发情处理
20. OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列叙述错误的是（　　）
A. 四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译
B. OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板
C. 应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞
D. 若转基因棉花的产量提高则可确定四个基因在棉花中成功表达
三、非选择题：本题共5小题，共55分。
21. 染料废水是一种难处理的工业废水。研究发现，活性污泥中能筛选出对蓝色的2BLN染料废水具有高效脱色能力的菌株，它们通过降解具生物毒性的分散蓝2BLN而降低废水危害。图1表示目标菌株GN-1的筛选和脱色实验流程，图2表示GN-1菌株接种量对脱色效果影响的实验结果。
（1）该实验需要制作多种培养基，这些培养基的配方不同，但一般都含有水、无机盐、______（答出2点）等物质，培养基制作后需使用______法进行灭菌。图1中含分散蓝2BLN的液体培养基甲的作用是______。
（2）图中所用到的接种方法是______。所示菌落①至④中，目标菌株GN-1应从菌落______（选填编号）中挑取。分离和纯化培养须使用固体培养基，理由是______。
（3）随着染料废水中分散蓝2BLN初始浓度的持续增加，CN-1菌株的脱色能力可能怎样变化？______。阐述分析过程______。根据图2所示结果，综合考虑脱色效果（6d脱色率达90%以上为合格）和经济效益，CN-1菌株的最佳接种量为______。
22. 同源四倍体的紫花苜被誉为“牧草之王”，但易造成家畜胀病；二倍体的百脉根因富含缩合单宁，饲喂时可防止家畜胀病的发生。某研究人员设计了下列技术路线，以期获得抗胀病的新型苜蓿。（注：IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的呼吸作用，二者有效抑制不同植物细胞正常代谢的临界浓度不同）
（1）据图可知，本研究主要利用的生物技术的原理是______。在实验前需通过预实验来探究R-6G或IOA使原生质体失去再生愈伤组织能力的临界浓度，设计思路是______。
（2）步骤①可采用化学法进行诱导，化学法除聚乙二醇融合法外，还有______法等。原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是_______。融合后的原生质体经过。______再生形成杂种细胞，进而经过②脱分化形成愈伤组织。
（3）步骤③先将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽培养基上，通常应在培养基中加入两类植物激素，其中起主要作用的是______。长出芽后，再将其转接到诱导生根培养基上，最终得到杂种植株。请判断：得到的杂种植株，理论上是否可育？并简要阐述理由：______
23. 科学家将C-Myc（原癌基因）、KI4（抑癌基因）、Sox2和Oct4等四种关键基因利用病毒转入高度分化的小鼠成纤维细胞内，获得iPS细胞，iPS细胞在适当的诱导条件下，可以定向分化成各种细胞。
（1）利用成纤维细胞获得iPS细胞的过程中，转入c-MyC、KIf4、Sox2和Oct4等的作用是______。iPS细胞的分化程度与______干细胞最接近。题目中所运用的病毒与诱导动物细胞融合时使用的病毒除种类可能不同外，还存在一个明显的区别是______。
（2）在培养过程中，iPS细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为______；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是______。
（3）2019年科学家利用成纤维细胞→①开启（）基因/关闭（）基因iPS细胞→②开启（）基因/关闭（）基因→角膜细胞过程，制作出一层0．5毫米厚的“眼角膜”细胞薄膜，进行移植并获得成功。下表是在定向诱导培养细胞过程中，成纤维细胞、iPS细胞和角膜细胞的三种基因（FSP-1、SOX-2、K12）及其控制合成的蛋白质的情况。结合表中信息，①和②过程中三种基因开启/关闭的情况分别为：①______，②_______。
　 FSP-1 SOX-2 K12
　 基因 蛋白质 基因 蛋白质 基因 蛋白质
成纤维细胞 + + + - + -
iPS细胞 + - + + + -
角膜细胞 + - + - + +
24. 如图是研究人员培育能生产人血清白蛋白牛乳转基因母牛的过程。回答下列问题：
（1）过程①中的质粒作为常用的载体，需要具备的条件是______。（答出2点）。血清白蛋白基因需在体外进行PCR扩增，扩增前应根据______设计引物，为方便构建基因表达载体，可在引物的______（填5'或3'）端添加限制酶识别序列。
（2）过程②利用的技术是_______，过程③一般采用______法将血清白蛋白基因导入受精卵。过程⑤的操作是______，其优势是______。在进行⑤之前需要对胚胎进行性别鉴定，应选择性染色体组成为______的胚胎进行操作。
（3）研究人员将早期胚胎进行分割后进行⑤操作，结果接受分割胚胎的其中一头健康母牛发生流产。从胚胎分割的角度分析，造成这种现象的原因可能是______。
25. 苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白具有良好的杀虫效果，Bt抗虫蛋白基因位于苏云金芽孢杆菌的质粒A上。培育转基因抗虫棉需要了解Bt基因的序列并得到完整的Bt基因，研究人员进行了如下实验：
（1）首先用限制酶HindIII处理质粒A，得到多个DNA片段，分别与质粒B连接，获得重组DNA分子，并将这些重组DNA分子导入经______处理的大肠杆菌中，构建了苏云金芽孢杆菌的部分基因组文库。研究人员利用抗Bt毒蛋白的抗体，进行______，并通过电泳检测上述文库中不同大肠杆菌菌株的Bt毒蛋白表达情况，结果如图1所示。根据电泳结果推测菌株3中仅插入了Bt基因的一部分序列，并非完整基因，作出这一推测的依据是______。对菌株3中插入的DNA片段序列进行测序（计为Bt-1序列），并根据序列制成了DNA探针M。
（2）研究人员又使用限制酶PsI切割质粒A，得到多个DNA片段。利用探针M通过______方法可确定其中含有Bt基因序列的DNA片段，进行测序（计为Bt-2序列）。如图2，为了得到完整的B基因，研究人员用限制酶______处理两段序列，同时加入______酶，获得重组DNA分子计为Bt-3。
（3）请设计实验验证Bt-3中包含完整的Bt基因，写出简要的实验思路和预期结果_____。实验材料及用具：大肠杆菌、质粒B、Bt-3、抗Bt毒蛋白抗体、蛋白质电泳装置及其他必需材料。
（4）将Bt基因导入棉花细胞前需要构建基因表达载体。含Bt基因的DNA片段与质粒上相关限制酶的酶切位点分别如图3、图4所示。
由图3和图4分析可知，为使Bt基因定向插入质粒中，应选择______。限制酶处理含Bt基因的DNA片段，在处理质粒的时候应选择______限制酶。
烟台市2022-2023学年高二下学期期中考试
生物 答案解析
注意事项：
1．答题前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。回答非选择题时，将答案写在答题卡上。写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求。
1. 下列有关传统发酵技术的描述，错误的是（　　）
A. 传统发酵技术所用的菌种一般是原料中天然存在的微生物
B. 传统发酵技术是微生物在有氧或无氧条件下物质的氧化分解
C. 传统发酵技术的目的是获得发酵产品或更多的微生物
D. 果酒、果醋、泡菜、酱油等是传统发酵技术的产物
【答案】C
【解析】
【分析】1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。
2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型；果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
3、泡菜的制作原理：泡菜的制作离不开乳酸菌，在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
【详解】A、传统发酵技术所用的菌种一般是原料中天然存在的微生物，培养过程中无需要严格灭菌，A正确；
B、传统发酵技术的本质是微生物在有氧或无氧条件下发生的物质氧化分解分解过程，并经过适当选用获得人们需要的产品，B正确；
C、传统发酵技术的目的是获得发酵产品用于制作食品，而不是获得更多的微生物，C错误；
D、果酒、果醋、泡菜、酱油等是传统发酵技术产物，都是利用天然存在的微生物制作的，D正确。
故选C。
2. 啤酒是以大麦为主要原料，经酿酒酵母发酵制得。啤酒的工业化生产分为主发酵和后发酵两个阶段。精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒不同，不添加食品添加剂，不进行过滤消毒处理。下列叙述正确的是（　　）
A. 利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B. 啤酒的工业化生产过程中，酒精的产生积累主要在主发酵阶段完成
C. 后发酵阶段会因pH或酒精含量升高而终止发酵
D. 精酿啤酒不进行过滤和消毒，故发酵过程不需要在无菌条件下进行
【答案】B
【解析】
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
【详解】A、利用大麦作原料时，淀粉需要分解成葡萄糖才能被酵母菌的利用，A错误；
B、啤酒发酵的过程分为主发酵和后发酵两个阶段，但酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，即酒精的产生积累主要在主发酵阶段完成，B正确；
C、主发酵结束后在低温、密闭环境下储存一段时间属于后发酵，后发酵阶段会因pH降低，且酒精含量升高而终止发酵，C错误；
D、精酿啤酒发酵时间长、产量低、价格高，保质期更短（在发酵工艺上，精酿啤酒发酵完成后，不会过滤和杀菌，保质期只有几十天，但发酵过程必须在无菌条件下进行，防止杂菌繁殖对发酵过程产生影响，D错误。
故选B。
3. 有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养，下图所示为操作流程。有关叙述错误的是（　　）
A. 在称取土壤、稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作
B. 用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需要进行灭菌处理
C. 步骤③中，将温度约50℃的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养
D. 步骤④中，划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
【答案】A
【解析】
【分析】由图分析可知，①表示称量土样，土样中含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释，目的是尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在；③表示倒平板，需要冷却到50℃左右，培养基才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，当感觉到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板。操作时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，以防止瓶口的微生物污染培养基；④表示平板划线法，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落，目的是纯化培养。
【详解】A、称取土壤、稀释土壤溶液的过程可以不用在火焰旁进行，A错误；
B、用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌处理，B正确；
C、步骤③表示倒平板，当感觉到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板，一般温度在50℃左右，C正确；
D 、步骤④表示平板划线法，平板划线时，应避免划破培养基表面，以免不能形成正常的单个菌落，D正确。
故选A。
【点睛】本题以工业生产中的实际问题和操作流程图，考查了微生物分离与培养的有关知识，要求考生掌握培养基的制作和微生物分离与纯化的方法，再结合各选项进行分析推理，准确判断。
4. 由于发酵工程生产条件温和、原料来源丰富、价格低廉等，在许多领域得到了广泛的应用。下列有关发酵工程在食品工业上应用的叙述，错误的是（　　）
A. 利用黑曲霉发酵制得的柠檬酸，广泛用于调节食品的酸度
B. 利用谷氨酸棒状杆菌发酵得到谷氨酸，经一系列处理制成味精
C. 利用乳酸菌在青贮饲料中乳酸发酵产生有机酸而实现饲料保鲜
D. 利用发酵工程从微生物细胞中提取单细胞蛋白制成微生物饲料
【答案】D
【解析】
【分析】发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品，主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵、产品的分离、提纯等方面。发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强，因而可以得到较为专一的产物。
【详解】A、柠檬酸是一种广泛应用的食品酸度调节剂，可以通过黑曲霉发酵制得，A正确；
B、利用谷氨酸棒状杆菌发酵产生谷氨酸，经一系列处理制成味精，属于发酵工程在食品工业上应用的实例，B正确；
C、制作青贮饲料时可用乳酸菌水剂喷洒，在青贮缸中厌氧条件下利用乳酸菌发酵产生乳酸，提高青贮品质，即利用乳酸菌在青贮饲料中乳酸发酵产生有机酸而实现饲料保鲜，C正确；
D、利用发酵工程产生的微生物细胞就是单细胞蛋白，可用于制成食品添加剂，D错误。
故选D。
5. 草莓是无性繁殖的作物，它感染的病毒很容易传播给后代。病毒在草莓体内逐年积累，会导致产量降低，品质变差。下图是育种工作者选育高品质草莓的流程图。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 方法一中，甲常选用茎尖，原因是其几乎未感染病毒
B. A、C两个过程属于植物组织培养，都经过脱分化和再分化
C. 通常采用70%的酒精和5%次氯酸钠溶液对甲进行消毒处理
D. 判断两种选育方法的效果都需要通过病毒接种实验
【答案】D
【解析】
【分析】植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
【详解】A、方法一为植物组织培养，选择茎尖作为组织培养材料的原因是该部位细胞的病毒含量少，甚至不带病毒，诱导更容易获得脱毒苗，A正确；
B、AC两个过程属于植物组织培养，都经过脱分化形成愈伤组织和再分化形成根芽，最终发育成植株，B正确；
C、对外植体的消毒通常采用体积分数为70%的酒精和5%次氯酸钠溶液，消毒后需用无菌水进行冲洗，C正确；
D、方法二为用基因工程选育高品质的抗病毒的草莓，其选育方法的效果需要通过病毒接种实验；方法一培育的是脱毒苗而非抗病毒苗，不需要接种病毒，D错误。
故选D。
6. 随着植物花药培养以及植物体细胞杂交技术等得以确立和发展，标志着植物细胞工程技术进入了高速发展的阶段。花粉原生质体具备单倍体的优点，可直接与体细胞原生质体融合，实现配子与体细胞杂交。下列叙述错误的是（　　）
A. 花粉可培育成单倍体植株，是细胞全能性的体现
B. 用低渗溶液配制纤维素酶和果胶酶溶液制备原生质体
C. 利用植物组织培养技术将融合细胞培育成完整植株
D. 配子与体细胞杂交能缩短三倍体无子果实培育年限
【答案】B
【解析】
【分析】植物体细胞杂交是指将不同来源的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞 培育成新植物体的技术，该技术的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性，其典型的优点是克服了远缘杂交不亲和的障碍。
【详解】A、花粉可培育成单倍体植株，说明生殖细胞具有全能性，是细胞全能性的体现，A正确；
B、用高渗溶液或等渗溶液配制纤维素酶和果胶酶溶液制备原生质体，这样可以避免原生质体吸水涨破，B错误；
C、通过植物组织培养技术将融合细胞培育成完整植株，利用了植物细胞具有全能性的原理，克服了远缘杂交不亲和的障碍，C正确；
D、配子与体细胞杂交通过植物组织培养技术获得三倍体能缩短三倍体无子果实培育年限，利用了植物细胞全能性的原理，D正确。
故选B。
7. 胚胎干细胞存在于哺乳动物的早期胚胎中，具有自我更新能力，在科学和医学领域具有极高的研究价值。早期胚胎干细胞的发育和自我更新受多个基因调控（如图）。下列叙述错误的是（　　）
A. 早期胚胎干细胞可分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞
B. Nanog基因突变可能使胚胎干细胞自我更新受阻
C. 促进Stat3和Oct3/4的表达会促进胚胎干细胞向滋养层分化
D. 将干细胞用于疾病的临床治疗可能存在导致肿瘤发生的风险
【答案】C
【解析】
【分析】题图分析，胚胎干细胞能自我更新，其中Nanog基因促进胚胎干细胞的增殖，抑制形成原始内胚层；Stat3能抑制胚胎干细胞的增殖和原始内胚层的形成；而OCT3/4能抑制胚胎干细胞表达形成滋养层。
【详解】A、胚胎干细胞具有发育的全能性，可分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，A正确；
B、Nanog基因促进胚胎干细胞的增殖，Nanog基因突变可能使胚胎干细胞自我更新受阻，B正确；
C、Stat3抑制胚胎干细胞的增殖和原始内胚层的形成，OCT3/4能抑制胚胎干细胞表达形成滋养层，则促进Stat3和Oct3/4的表达会抑制胚胎干细胞的增殖和分化过程，C错误；
D、由于干细胞可无限增殖，将干细胞用于疾病的临床治疗可能存在导致肿瘤发生的风险，D正确。
故选C。
8. 科学家将大熊猫的体细胞和兔子的去核卵母细胞构建成重组细胞，使重组细胞成功发育为囊胚，标志着异种核质相容问题得到解决，异种克隆大熊猫迈过了第一道“坎”。下列说法错误的是（　　）
A. 获取卵母细胞前，用含促性腺激素的饲料饲喂兔子可使其超数排卵
B. 可通过梯度离心法去除兔子卵母细胞中的细胞核
C. 可将大熊猫的体细胞直接注入兔子的去核卵母细胞
D. 选用的去核卵母细胞中的细胞质已成熟，可支持重组细胞发育成胚胎
【答案】A
【解析】
【分析】动物克隆技术即核移植技术，利用处于MII期卵母细胞的细胞质使已分化的细胞核恢复分裂能力。
【详解】A、促性腺激素的化学本质是蛋白质，用含促性腺激素的饲料饲喂兔子会使其失活，A错误；
B、可通过梯度离心、紫外线短时间照射等方法去除兔子卵母细胞中的细胞核，B正确；
C、可将大熊猫的体细胞直接注入兔子的去核卵母细胞，然后通过电融合法使两细胞融合，C正确；
D、选用的去核卵母细胞中的细胞质已成熟，含有使已分化的细胞核恢复分裂能力的物质，可支持重组细胞发育成胚胎，D正确。
故选A。
9. 将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合形成抗体-药物偶联物（ADC），可实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。下列叙述错误的是（　　）
A. 制备单克隆抗体应用的技术主要是动物细胞培养和动物细胞融合
B. 制备单克隆抗体时，至少需经过两次筛选才能得到分泌所需抗体的杂交瘤细胞
C. ADC与肿瘤细胞表面的抗原结合后，以胞吞的方式进入肿瘤细胞
D. ADC中的单克隆抗体起导向作用，能特异性结合并杀伤肿瘤细胞
【答案】D
【解析】
【分析】单克隆抗体制备过程：用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞→诱导与培养好的骨髓瘤细胞融合→用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长→对选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞→将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增殖→从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
【详解】A、单克隆抗体的制备需要用到动物细胞培养，动物细胞融合等技术，A正确；
B、制备单克隆抗体时，需经过两次筛选才能得到符合要求的杂交瘤细胞，第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选目的是为了筛选出能产生所需的单一抗体的杂交瘤细胞，B正确；
C、将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合形成抗体-药物偶联物（ADC），ADC与肿瘤细胞表面的抗原结合后，以胞吞的方式进入肿瘤细胞，C正确；
D、ADC能借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在的位置，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤，D错误。
故选D。
10. 下列有关哺乳动物精子和卵子的发生及受精作用的叙述，错误的是（　　）
A. 雌性动物排出成熟卵细胞的过程即为排卵
B. 精子入卵后，卵子被激活才能完成减数分裂Ⅱ
C. 防止多精入卵的屏障是透明带反应和卵细胞膜反应
D. 受精的实质是精子形成的雄原核和卵子形成的雌原核的融合
【答案】A
【解析】
【分析】哺乳动物精子和卵子发生的不同点：
（1）精子的减数两次分裂是连续的，场所唯一（MⅠ和MⅡ的场所都是睾丸）；而卵子的两次分裂是不连续的，场所不唯一．（MⅠ场所在卵巢，MⅡ场所在输卵管中）。
（2）精子和卵子发生的时间不同：精子的发生是从初情期一直到生殖机能衰退；多数哺乳动物卵子的形成和在卵巢内的贮备是胎儿出生前完成的；MⅠ是在雌性动物排卵前后完成的，MⅡ是在受精过程中完成的。
（3）精子的形成过程需要变形；卵细胞的形成过程不需要变形。
【详解】A、排卵发生在减数第一次分裂前后，因此排卵排出的可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞，并不是成熟的卵细胞，A错误；
B、卵子发育到MⅡ期时才能与精子受精，精子入卵后，卵子被激活才能完成减数分裂Ⅱ，B正确；
C、透明带反应是防止多精子进入卵受精的第一道屏障，卵细胞膜反应是防止多精子入卵受精的第二道屏障，C正确；
D、受精的实质是精子形成的雄原核和卵子形成的雌原核的融合，雄原核一般略大于雌原核，D正确。
故选A。
11. 临床研究证明，全胚冷冻后的单囊胚移植能显著提高胚胎着床率、妊娠率及活产率，以及单胎新生儿的出生体重。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 囊胚的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织
B. 选择囊胚期进行胚胎移植的原因是该时期细胞还未分化
C. 通过胚胎分割技术可以获得基因型相同的双胞胎
D. 冷冻后再开展胚胎移植可能消除胚胎新鲜时移植存在的不利于胚胎着床的因素
【答案】B
【解析】
【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理（选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体．用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理）；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存（对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段）；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。
【详解】A、囊胚的内细胞团具有全能性，将来发育成胎儿的各种组织，A正确；
B、囊胚期的细胞已经出现分化，分化为内细胞团和滋养层，B错误；
C、来自同一个胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割技术可以获得基因型相同的个体，C正确；
D、分析题意可知，全胚冷冻后的单囊胚移植能显著提高胚胎着床率、妊娠率及活产率，以及单胎新生儿的出生体重，据此推测冷冻后再开展胚胎移植可能消除胚胎新鲜时移植存在的不利于胚胎着床的因素，D正确。
故选B。
12. 下表所示为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是（　　）
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 注：Y=C或T，R=A或C
BglII A↓GATCT KpnI CCTAC↓C
EcoRI G↓AATTC MbooI ↓GATC
HindI GTY↓RAC SmaI CCC↓GGG
A. 限制酶的作用底物都是双链DNA，都能切开磷酸二酯键
B. BglⅡ和MbooI两种限制酶切后可形成相同的黏性末端
C. SmaI切DNA后成的末端可用Ecoli DNA连接酶连接
D. 一种限制酶可能识别多种核苷酸序列
【答案】C
【解析】
【分析】限制酶：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来；（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（3）结果：形成黏性末端或平末端。
【详解】A、限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，A正确；
B、BglⅡ和MbooI两种限制酶切后可形成相同的黏性末端，均为GATC—，B正确；
C、SmaI切DNA后成的末端为平末端，而Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端，C错误；
D、HindI限制酶的识别序列为GTY↓RAC，其中Y=C或T，R=A或G，说明其识别序列不只一种，则一种限制酶可能识别多种核苷酸序列，D正确。
故选C。
13. 天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延级药效。科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（　　）
A. 设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始
B. 该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造
C. 速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则
D. 该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素
【答案】D
【解析】
【分析】1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）；
2.蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
【详解】A、对胰岛素进行分子设计的主要依据是胰岛素的预期功能，而后再进行预期蛋白质结构的设计，A正确；
B、设计胰岛素的改造中，要对胰岛素基因的结构进行改造，因此，蛋白质工程又叫做第二代基因工程，B正确；
C、速效胰岛素的化学本质是蛋白质，因此其在受体细胞中合成时遵循中心法则，C正确；
D、该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，不能直接生产有生物活性的胰岛素，因为大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，因而不能对多肽链进行加工，D错误。
故选D。
14. 某研究小组利用鸡血细胞进行”DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述错误的是（　　）
A. 可用蒸馏水使细胞吸水涨破，释放DNA
B. 可用95%的冷酒精溶解过滤后留在纱布上的DNA
C. 使用玻璃棒时应沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整
D. 将丝状物加入2mol/L的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后出现蓝色
【答案】B
【解析】
【分析】DNA的粗提取和分离
1、DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3、DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】A、蒸馏水渗透压低于细胞内渗透压，可用蒸馏水使细胞吸水涨破，释放DNA，A正确；
B、利用某些蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精的原理，可用体积分数为95%的冷酒精析出DNA，而不是溶解，B错误；
C、用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整，C正确；
D、DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，可用二苯胺沸水浴鉴定DNA，将丝状物DNA溶解于2mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色，D正确。
故选B。
15. RT-PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是（　　）
A. PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+
B. 一般情况下，引物A和B的长度越长C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越低
C. PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色
D. 实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
【答案】B
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
【详解】A、PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+，镁离子能激活DNA聚合酶，A正确；
B、一般情况下，引物A和B的长度越长，C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越高，B错误；
C、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检测出来，C正确；
D、实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正确。
故选B。
二、选择题：本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
16. 抗生素I-IV均可治疗黄色葡萄球菌（Sau）引起的肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者将分别含等剂量抗生素的四张大小相同的滤纸片置于Sau均匀分布的平板培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 配制培养基时应将培养基的pH调至微酸性
B. 测量菌落和抑菌圈直径时应直接在皿盖上测量
C. 抗生素IV治疗Sau感染引起的肺炎效果最好
D. 抑菌圈中出现菌落可能是Sau发生了基因突变
【答案】CD
【解析】
【分析】培养基的概念及营养构成
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质；
（2）营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【详解】A、该培养基培养的是金黄色葡萄球菌，属于细菌，因此，在配制培养基时应将培养基的pH调至中性或微碱性，A错误；
B、测量菌落和抑菌圈直径时应直接在皿底上测量，这样可以避免杂菌污染，B错误；
C、结合图示可知，抗生素IV获得的抑菌圈最大，因而治疗Sau感染引起的肺炎效果最好，C正确；
D、抑菌圈中出现的菌落可能是Sau发生了基因突变，因而具有了对抗生素的抗性，D正确。
故选CD。
17. 植物细胞工程技术包括植物组织培养技术和体细胞杂交技术，在快速繁殖、农作物育种及提高农作物产量等方面具有广泛应用。下列有关说法错误的是（　　）
A. 可以利用植物组织培养脱分化所得到的胚状体等为材料制备人工种子
B. 由茎尖细胞形成愈伤组织的过程中，可能会发生基因突变和基因重组
C. 进行植物体细胞杂交的实验，不必考虑亲本细胞的生殖隔离问题
D. 利用灭活的病毒能诱导植物原生质体融合的原理是细胞膜具有流动性
【答案】ABD
【解析】
【分析】1.植物细胞工程技术的应用：植物繁殖的新途径（包括微型繁殖，作物脱毒、人工种子等）、作物新品种的培育（单倍体育种、突变体的利用）、细胞产物的工厂化生产。
2.植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
【详解】A、可以利用植物组织培养再分化所得到的胚状体等为材料加上人工种皮以及相应的营养物质和一些激素，可制备人工种子，A错误；
B、由茎尖细胞形成愈伤组织的过程中，可能会发生基因突变，但不会发生基因重组，因为基因重组发生在减数分裂过程中，B错误；
C、植物体细胞杂交技术最大的优点就是克服生物远缘杂交不亲和的障碍，因此，进行植物体细胞杂交的实验，不必考虑亲本细胞的生殖隔离问题，C正确；
D、利用聚乙二醇诱导植物原生质体融合的原理是细胞膜具有流动性，灭活病毒诱导法是诱导动物细胞融合的特有方法，D错误。
故选ABD。
18. 研究发现；细胞膜上的转铁蛋白受体（TfR）与转铁蛋白（Tf）结合，可将铁元素运输至胞内。肿瘤细胞内铁元素浓度远高于正常细胞。科学家利用单克隆抗体技术，研制出鼠源性抗TfR抗体，可用于治疗小鼠肿瘤。下列说法错误的是（　　）
A. 肿瘤细胞表面TfR的表达量多于正常细胞
B. 抗TfR抗体通过阻止Tf与TfR的结合来抑制铁元素的摄取，抑制肿瘤细胞增长
C. 制备单克隆抗体时需给小鼠接种TfR，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
D. 经特定选择培养基筛选出的杂交瘤细胞可直接注射到小鼠腹腔内增殖
【答案】D
【解析】
【分析】单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的效应B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能产生抗体，又能无限增殖。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原的特异性抗体即单克隆抗体。
【详解】A、题意显示，细胞膜上的转铁蛋白受体（TfR）与转铁蛋白（Tf）结合，可将铁元素运输至胞内，而肿瘤细胞内铁元素浓度远高于正常细胞，据此可推测，肿瘤细胞表面TfR的表达量多于正常细胞，A正确；
B、抗TfR抗体通过阻止Tf与TfR的结合来抑制铁元素的摄取，进而降低肿瘤细胞内铁元素的含量，抑制肿瘤细胞增长，B正确；
C、制备单克隆抗体时需给小鼠接种TfR，TfR作为抗原能刺激小鼠发生特异性免疫反应，因而，可从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞，为单克隆抗体的制备作准备，C正确；
D、经特定选择培养基筛选出的杂交瘤细胞还需要进一步筛选才能获得产生特定抗体的杂交瘤细胞，而后才可注射到小鼠腹腔内大量培养，D错误。
故选D。
19. 繁育“试管动物”时，合成培养液与共同培养体系被广泛用于早期胚胎的体外培养。共同培养体系是将受精卵和体细胞在体外共同培养，利用体细胞分泌的未知的分泌物来促进胚胎的发育。培养时，将体细胞处理后铺成单层细胞，作为胚胎发育的滋养层。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理
B. 合成培养液中通常要加入血清，还要定期更换
C. 共同培养体系能模拟体内环境，使细胞间能沟通信息，相互支撑
D. 代孕母畜可以是同种的或不同物种的，需对供体和受体进行同期发情处理
【答案】ABC
【解析】
【分析】试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精,并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑棋胚或囊胚，对囊胚阶段的胚胎进行分割时要注意将内细胞团等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【详解】A、采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理 才能完成受精作用，A正确；
B、因为人们对动物细胞培养所需要的物质尚不明确，因此在合成培养液中通常要加入血清，且还要定期更换，目的是为了让培养的动物细胞获得足够的营养，B正确；
C、共同培养体系是将受精卵和体细胞在体外共同培养，利用体细胞分泌的未知的分泌物来促进胚胎的发育，可见共同培养体系能模拟体内环境，使细胞间能实现信息交流，C正确；
D、代孕母畜可以是同种的健康的雌性动物，需对供体和受体进行同期发情处理，这样可以使受体为供体胚胎提供相同的生理环境，D错误。
故选ABC。
20. OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列叙述错误的是（　　）
A. 四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译
B. OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板
C. 应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞
D. 若转基因棉花的产量提高则可确定四个基因在棉花中成功表达
【答案】AC
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、四个基因在叶绿体外合成蛋白质，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，即这四个基因的转录和翻译过程都在叶绿体外完成，A错误；
B、启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，图中OsGLO1、EcCAT基因启动子的位置不同，因而，转录时以DNA的不同单链为模板，B正确；
C、卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，没有转移到宿主细胞的染色体DNA上，因此应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；
D、通过导入四个基因，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量，据此推测，若转基因棉花的产量提高则可确定四个基因在棉花中成功表达，D正确。
故选AC。
三、非选择题：本题共5小题，共55分。
21. 染料废水是一种难处理的工业废水。研究发现，活性污泥中能筛选出对蓝色的2BLN染料废水具有高效脱色能力的菌株，它们通过降解具生物毒性的分散蓝2BLN而降低废水危害。图1表示目标菌株GN-1的筛选和脱色实验流程，图2表示GN-1菌株接种量对脱色效果影响的实验结果。
（1）该实验需要制作多种培养基，这些培养基的配方不同，但一般都含有水、无机盐、______（答出2点）等物质，培养基制作后需使用______法进行灭菌。图1中含分散蓝2BLN的液体培养基甲的作用是______。
（2）图中所用到的接种方法是______。所示菌落①至④中，目标菌株GN-1应从菌落______（选填编号）中挑取。分离和纯化培养须使用固体培养基，理由是______。
（3）随着染料废水中分散蓝2BLN初始浓度的持续增加，CN-1菌株的脱色能力可能怎样变化？______。阐述分析过程______。根据图2所示结果，综合考虑脱色效果（6d脱色率达90%以上为合格）和经济效益，CN-1菌株的最佳接种量为______。
【答案】（1） ①. 碳源、氮源 ②. 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） ③. 选择和扩增培养GN-1菌种）
（2） ①. 涂布平板法 ②. ③ ③. 固体培养基表面才能长出由单个微生物繁殖而成的菌落
（3） ①. 增强 ②. 在高浓度染料的选择作用下，脱色能力强的GN-1菌株被选择出来，有利变异积累，导致脱色能力增强 ③. 15%
【解析】
【分析】培养基的概念及营养构成
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质；
（2）营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【小问1详解】
该实验需要制作多种培养基，这些培养基的配方不同，但一般都含有水、无机盐、碳源和氮源等物质，培养基制作后需使用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，高压蒸汽灭菌属于湿热灭菌法。图1中含分散蓝2BLN的液体培养基甲的作用是选择和扩增培养GN-1菌种），进而能保证对GN-1菌种筛选成功。
【小问2详解】
向含分散蓝2BLN的LB固体培养基中进行接种时，应采用稀释涂布平板法，该方法可获得单菌落，培养结果如图1所示，由图1可知，目标菌株GN-1可通过降解具生物毒性的分散蓝2BLN而降低废水危害，其脱色能力有强有弱，图1所示的菌落①至④中，透明圈越大，该菌脱色能力越强，故挑选菌落③。分离和纯化培养须使用固体培养基，这是因为固体培养基表面才能长出由单个微生物繁殖而成的菌落，且通常需要根据菌落的特征对培养的菌种进行鉴别。
小问3详解】
结合图2结果可知，随着染料废水中分散蓝2BLN初始浓度的持续增加，CN-1菌株的脱色能力表现为逐渐增强，出现该现象的原因应该是随着染料初始浓度的持续增加，GN-1菌株的脱色能力可能会产生变化，即由于高浓度的染料对GN-1菌株起了选择作用，脱色能力强的菌株被选择出来，有利变异积累，导致脱色能力增强。由图2可知，6d脱色率达90%以上为合格，合格的只有15%和20%，综合考虑脱色效果和经济效益，应选择15%。
22. 同源四倍体的紫花苜被誉为“牧草之王”，但易造成家畜胀病；二倍体的百脉根因富含缩合单宁，饲喂时可防止家畜胀病的发生。某研究人员设计了下列技术路线，以期获得抗胀病的新型苜蓿。（注：IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的呼吸作用，二者有效抑制不同植物细胞正常代谢的临界浓度不同）
（1）据图可知，本研究主要利用的生物技术的原理是______。在实验前需通过预实验来探究R-6G或IOA使原生质体失去再生愈伤组织能力的临界浓度，设计思路是______。
（2）步骤①可采用化学法进行诱导，化学法除聚乙二醇融合法外，还有______法等。原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是_______。融合后的原生质体经过。______再生形成杂种细胞，进而经过②脱分化形成愈伤组织。
（3）步骤③先将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽培养基上，通常应在培养基中加入两类植物激素，其中起主要作用的是______。长出芽后，再将其转接到诱导生根培养基上，最终得到杂种植株。请判断：得到的杂种植株，理论上是否可育？并简要阐述理由：______
【答案】（1） ①. 细胞膜的流动性和植物细胞的全能性 ②. 将获取的原生质体分别放置在不同浓度的R-6G或IOA溶液中，培养一段时间后，观察原生质体再生情况
（2） ①. 高Ca2+-高pH融合 ②. 保持原生质体完整性 ③. 细胞壁
（3） ①. 细胞分裂素 ②. 可育，杂种植株细胞中含有成对的同源染色体
【解析】
【分析】植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。植物体细胞杂交依据的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
【小问1详解】
由图可知，新型苜蓿的培育过程采用的是植物体细胞杂交技术，该生物技术的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性；在实验前需通过预实验来探究R-6G或IOA使原生质体失去再生愈伤组织能力的临界浓度，由于需要获得 具体的浓度，因此需要将获取的原生质体分别放置在不同浓度的R-6G或IOA溶液中，培养一段时间后，观察原生质体再生情况，根据再生情况获得各自的临界值。
【小问2详解】
步骤①可采用化学法进行诱导，其中化学方法除了聚乙二醇（PEG）融合法，还有高Ca2+—高pH融合法等。原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，保持原生质体完整性，防止原生质体吸水涨破。融合后的原生质体再生出新的细胞壁说明形成杂种细胞，即杂种细胞形成的标志是再生出细胞壁，进而经过②脱分化形成愈伤组织。
【小问3详解】
步骤③先将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽培养基上，通常应在培养基中加入两类植物激素，分别是生长素和细胞分裂素，其中起主要作用的是细胞分裂素。长出芽后，再将其转接到诱导生根培养基上，最终得到杂种植株。紫花苜蓿是同源四倍体，体细胞含有4个染色体组，百脉根是二倍体，体细胞含有2个染色体组，融合后得到的杂种细胞含有4+2=6个染色体组，可见，杂种植株细胞中含有成对的同源染色体，因而能进行正常的减数分裂过程，因而表现为可育。
23. 科学家将C-Myc（原癌基因）、KI4（抑癌基因）、Sox2和Oct4等四种关键基因利用病毒转入高度分化的小鼠成纤维细胞内，获得iPS细胞，iPS细胞在适当的诱导条件下，可以定向分化成各种细胞。
（1）利用成纤维细胞获得iPS细胞的过程中，转入c-MyC、KIf4、Sox2和Oct4等的作用是______。iPS细胞的分化程度与______干细胞最接近。题目中所运用的病毒与诱导动物细胞融合时使用的病毒除种类可能不同外，还存在一个明显的区别是______。
（2）在培养过程中，iPS细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为______；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是______。
（3）2019年科学家利用成纤维细胞→①开启（）基因/关闭（）基因iPS细胞→②开启（）基因/关闭（）基因→角膜细胞过程，制作出一层0．5毫米厚的“眼角膜”细胞薄膜，进行移植并获得成功。下表是在定向诱导培养细胞过程中，成纤维细胞、iPS细胞和角膜细胞的三种基因（FSP-1、SOX-2、K12）及其控制合成的蛋白质的情况。结合表中信息，①和②过程中三种基因开启/关闭的情况分别为：①______，②_______。
　 FSP-1 SOX-2 K12
　 基因 蛋白质 基因 蛋白质 基因 蛋白质
成纤维细胞 + + + - + -
iPS细胞 + - + + + -
角膜细胞 + - + - + +
【答案】（1） ①. 诱导已分化细胞转变为未分化细胞 ②. 胚胎（全能） ③. 此处病毒不需要灭活，细胞融合时必须用灭活的病毒
（2） ①. 接触抑制 ②. 抑制多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活
（3） ①. 开启SOX-2基因，关闭FSP-1基因 ②. 开启K12基因，关闭SOX-2基因
【解析】
【分析】1.灭活病毒诱导细胞融合的方法适用于动物细胞的融合，通常使用灭活的仙台病毒，既物理或化学的手段，使病毒失去感染力，但不破坏其抗原结构。原理是利用灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
2.干细胞是一类具有自我复制能力、多潜能未分化细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞（胚胎干细胞）、多能干细胞和单能干细胞。多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能，如造血干细胞。
3.细胞的接触抑制：细胞表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。
4.动物组织细胞适宜生活的内环境的酸碱度为中性略偏碱性的7.35~7.45之间，而胰蛋白酶的活性在中性略偏碱性的环境下最佳，胃蛋白酶的活性在强酸性的环境下最佳，因此用胰蛋白酶，不用胃蛋白酶。
5.根据表格信息可知，成纤维细胞中FSP-1控制合成了相应蛋白质，而SOX-2和K12没有控制合成相应的蛋白质，说明成纤维细胞中开启了FSP-1，关闭了SOX-2和K12；iPS细胞中FSP-1和K12没有控制合成了相应的蛋白质，而SOX-2控制合成了相应的蛋白质，说明iPS细胞中开启了SOX-2，关闭了FSP-1和K12；角膜细胞中FSP-1和SOX-2没有控制合成了相应的蛋白质，而K12控制合成了相应的蛋白质，说明角膜细胞中开启了K12，关闭了FSP-1和SOX-2。
【小问1详解】
成纤维细胞是高度分化的细胞，而iPS细胞是多能干细胞，所以利用成纤维细胞获得iPS细胞的过程中，转入c-MyC、KIf4、Sox2和Oct4等的作用是诱导已分化细胞转变为未分化细胞。全能干细胞的分化程度与多能干细胞最接近。灭活的病毒可以用于诱导动物细胞融合，活的病毒可以充当基因工程的载体，而题目中利用病毒转入高度分化的小鼠成纤维细胞内，获得iPS细胞属于基因工程，病毒不需要灭活。
【小问2详解】
细胞在培养瓶中贴壁生长，相互接触时停止繁殖的现象称为细胞的接触抑制。动物组织细胞适宜生活的内环境的酸碱度为中性略偏碱性的7.35~7.45之间，而胃蛋白酶的活性在强酸性的环境下最佳，若用胃蛋白酶处理，胃蛋白酶在此环境中没有活性。
【小问3详解】
由题意可知，①过程要将成纤维细胞→iPS细胞，而根据表格信息，成纤维细胞中开启了FSP-1，关闭了SOX-2和K12，iPS细胞中开启了SOX-2，关闭了FSP-1和K12，因此只需要开启SOX-2基因，关闭FSP-1基因。②过程要将iPS细胞→角膜细胞，而根据表格信息，iPS细胞中开启了SOX-2，关闭了FSP-1和K12，角膜细胞中开启了K12，关闭了FSP-1和SOX-2，因此只需要开启K12基因，关闭SOX-2基因。
【点睛】本题考查细胞分化、基因的表达、基因工程和细胞工程的相关知识，要求考生识记和理解基因的表达和动物细胞培养的过程及原理。考生关键要能准确从题干中获取信息，结合所学的知识进行综合分析，得出结论，才能准确作答。
24. 如图是研究人员培育能生产人血清白蛋白牛乳的转基因母牛的过程。回答下列问题：
（1）过程①中的质粒作为常用的载体，需要具备的条件是______。（答出2点）。血清白蛋白基因需在体外进行PCR扩增，扩增前应根据______设计引物，为方便构建基因表达载体，可在引物的______（填5'或3'）端添加限制酶识别序列。
（2）过程②利用的技术是_______，过程③一般采用______法将血清白蛋白基因导入受精卵。过程⑤的操作是______，其优势是______。在进行⑤之前需要对胚胎进行性别鉴定，应选择性染色体组成为______的胚胎进行操作。
（3）研究人员将早期胚胎进行分割后进行⑤操作，结果接受分割胚胎的其中一头健康母牛发生流产。从胚胎分割的角度分析，造成这种现象的原因可能是______。
【答案】（1） ①. 能在受体细胞中自我复制，或整合到染色体DNA上、具有一至多个限制酶切点、具有标记基因 ②. 血清白蛋白基因两侧的脱氧核苷酸序列 ③. 5'
（2） ①. 体外受精 ②. 显微注射 ③. 胚胎移植 ④. 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力 ⑤. XX
（3）桑葚胚或囊胚的内细胞团未均等分割，胚胎发育停滞或无法发育
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建（核心步骤）、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
质粒作为常用的载体，需要具备的条件是能在受体细胞中自我复制，或整合到染色体DNA上、具有一至多个限制酶切点、具有标记基因；血清白蛋白基因需在体外进行PCR扩增，扩增前应根据血清白蛋白基因两侧的脱氧核苷酸序列设计引物；为了使经PCR 扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。在2种引物的5′端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。
小问2详解】
分析题图可知，过程②卵细胞和精子进行体外受精形成受精卵；过程③将重组质粒导入受精卵，一般采用显微注射法；过程⑤的操作是胚胎移植，其可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力；由于图中的目的是要获得乳腺生物发生器，需要获取雌性的胚胎， 因此，需要进行性别鉴定，选取染色体组成为XX的胚胎进行移植。
【小问3详解】
研究人员将早期胚胎进行分割后进行⑤操作，结果接受分割胚胎的其中一头健康母牛发生流产，造成这种现象的原因可能是桑葚胚或囊胚的内细胞团未均等分割，胚胎发育停滞或无法发育。
25. 苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白具有良好的杀虫效果，Bt抗虫蛋白基因位于苏云金芽孢杆菌的质粒A上。培育转基因抗虫棉需要了解Bt基因的序列并得到完整的Bt基因，研究人员进行了如下实验：
（1）首先用限制酶HindIII处理质粒A，得到多个DNA片段，分别与质粒B连接，获得重组DNA分子，并将这些重组DNA分子导入经______处理的大肠杆菌中，构建了苏云金芽孢杆菌的部分基因组文库。研究人员利用抗Bt毒蛋白的抗体，进行______，并通过电泳检测上述文库中不同大肠杆菌菌株的Bt毒蛋白表达情况，结果如图1所示。根据电泳结果推测菌株3中仅插入了Bt基因的一部分序列，并非完整基因，作出这一推测的依据是______。对菌株3中插入的DNA片段序列进行测序（计为Bt-1序列），并根据序列制成了DNA探针M。
（2）研究人员又使用限制酶PsI切割质粒A，得到多个DNA片段。利用探针M通过______方法可确定其中含有Bt基因序列的DNA片段，进行测序（计为Bt-2序列）。如图2，为了得到完整的B基因，研究人员用限制酶______处理两段序列，同时加入______酶，获得重组DNA分子计为Bt-3。
（3）请设计实验验证Bt-3中包含完整的Bt基因，写出简要的实验思路和预期结果_____。实验材料及用具：大肠杆菌、质粒B、Bt-3、抗Bt毒蛋白抗体、蛋白质电泳装置及其他必需材料。
（4）将Bt基因导入棉花细胞前需要构建基因表达载体。含Bt基因的DNA片段与质粒上相关限制酶的酶切位点分别如图3、图4所示。
由图3和图4分析可知，为使Bt基因定向插入质粒中，应选择______。限制酶处理含Bt基因的DNA片段，在处理质粒的时候应选择______限制酶。
【答案】（1） ①. Ca2+ ②. 抗原-抗体杂交 ③. 菌株3中Bt基因表达的蛋白质的分子量小于Bt毒蛋白的分子量
（2） ①. DNA分子杂交 ②. Hindll或PstI ③. DNA连接
（3）实验思路：将Bt-3与质粒B连接构建重组DNA后，导入大肠杆菌；用抗Bt毒蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交；并通过电泳检测该大肠杆菌菌株的Bt毒蛋白表达情况预期结果：大肠杆菌中Bt-3表达的蛋白质的分子量等于Bt毒蛋白的分子量
（4） ①. Spel和 Sau3Al ②. Spel和 BamHI
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
用Ca2+处理大肠杆菌，使大肠杆菌处于感受态，有利于重组DNA分子的导入，由此构建了苏云金芽孢杆菌的部分基因组文库。
利用抗Bt毒蛋白的抗体，运用抗原-抗体杂交技术，可以挑选出成功表达BT基因的大肠杆菌菌株。电泳结果显示，菌株3中Bt基因表达的蛋白质的分子量小于Bt毒蛋白的分子量，据此推测菌株3中仅插入了Bt基因的一部分序列，并非完整基因。对菌株3中插入的DNA片段序列进行测序（计为Bt-1序列），并根据序列制成了DNA探针M，如图所示。
【小问2详解】
研究人员又使用限制酶PsI切割质粒A，得到多个DNA片段。利用探针M通过DNA分子杂交方法可确定其中含有Bt基因序列的DNA片段，进行测序（计为Bt-2序列）。如图2，根据图2中两段DNA序列含有的限制酶识别位点可推测，为了得到完整的Bt基因，研究人员用限制酶HindⅢ或PstⅠ处理两段序列，同时加入DNA连接酶，获得重组DNA分子计为Bt-3。
【小问3详解】
请设计实验验证Bt-3中包含完整的Bt基因，需要设法让Bt-3进行表达，并用相应的抗Bt毒蛋白抗体进行检测，通过电泳进行检测，因此实验思路如下：将Bt-3与质粒B连接构建重组DNA后，导入大肠杆菌；用抗Bt毒蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交；并通过电泳检测该大肠杆菌菌株的Bt毒蛋白表达情况；因为要验证Bt-3中包含完整的Bt基因，因此相应的结果应该为：大肠杆菌中Bt-3表达的蛋白质的分子量等于Bt毒蛋白的分子量。
【小问4详解】
由图3和图4分析可知，为使Bt基因定向插入质粒中，在构建基因表达载体时，目的基因需要插入到启动子和终止子之间，需要用Spel和 Sau3Al两种限制酶切割含抗虫基因的DNA片段，BamHⅠ和Sau3AⅠ可以获得相同黏性末端，在处理质粒的时候应选择Spel和 BamHI两种限制酶，这样可以避免自身环化和反向连接，保证目的基因正向插入质粒中。