（16）基因工程——2024年高考生物学真题模拟试题专项汇编（有解析）

（16）基因工程
——2024年高考生物学真题模拟试题专项汇编
一、非选择题
1．[2024届·甘肃·模拟考试]胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是（ ）
A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步
B.构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酵
C.大肠杆菌细胞经Ca2+处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D.抗原-抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
2．[2024届·山东·模拟考试]国家“863”计划在现代农业技术领域设置了多个具有重要价值的主题项目，其中“动植物生物反应器”课题组建立了植物油体、胚乳、悬浮细胞及动物乳腺生物反应器等几大技术平台、
（1）悬浮细胞生物反应器是指将脱分化的愈伤组织在液体培养基中繁殖以提取产物。该生物反应器用到细胞工程中的___________技术，该技术的主要优点有_____________（至少答出两条）。
（2）叶绿体生物反应器是指通过特定的技术手段使外源基因能够进入到叶绿体中，与植物叶绿体基因组进行同源片段重组，在叶绿体中进行转录、翻译的技术体系。该技术可能存在的缺点是___________。
（3）科学家利用水稻胚乳反应器表达重组HN蛋白生产新城疫（一种急性、致死性禽类传染病）疫苗，部分过程如下：
①利用双酶切法将HN基因成功连接到了植物载体上，重组载体中HN基因应该正确连接到___________序列之间。为保证HN基因只在水稻胚乳细胞中正确表达，需要___________。
②利用____________法，将重组载体转入水稻愈伤组织。经过暗培养、愈伤筛选、分化、生根和移栽，4个月后获得转基因水稻种子。为证明HN基因在水稻胚乳中已经转录，将待测胚乳细胞制成匀浆，采用逆转录PCR法进行检测。请你评价能否达成目的，并简要说明理由___________。
3．[2024届·河北·二模]我国科学家发现拟南芥中的光敏蛋白（PhyA）能在红光（660nm）照射下与其伴侣蛋白（FHY1）形成二聚体，并在远红光（730nm）照射下解离。根据这一特点，研究人员构建了基于PhyA-FHY1的转录激活系统，将PhyA与某些基因的启动子结合蛋白融合表达（产生融合蛋白A），将FHY1和另一种转录激活蛋白融合表达（产生融合蛋白B）。在红光（660nm）刺激下，融合蛋白A和融合蛋白B可结合形成复合体并促进RNA聚合酶与DNA结合，从而启动特定基因的表达。请根据题干信息及所学内容回答下列问题：
（1）融合蛋白是指由两个或多个不同蛋白质连接而成的单一多肽链。要实现融合蛋白在细胞内表达的前提是使用工具酶____________和___________将两种蛋白质的基因拼接在一起。
（2）使用____________反应可将融合后的目的基因进行扩增，该反应需在一定的缓冲液中进行，需提供目的基因、__________、__________和耐高温的DNA聚合酶。缓冲液中添加Mg2+的原因是__________。扩增完成后常用___________来鉴定反应的产物。
（3）研究人员将PhyA-FHY1的转录激活系统与小鼠胰岛素基因相关联后，培育出小鼠工程化细胞。将这些细胞移植至小鼠皮下后即可分别通过___________方式开启和关闭细胞内胰岛素基因的表达，并通过_______________来控制其胰岛素生成量。
4．[2024年湖北高考真题]苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出，直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。
回答下列问题：
（1）Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于________（填“细胞坏死”或“细胞凋亡”）。
（2）如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低，取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和________产生新的肠道细胞，修复损伤的肠道，由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路：________。
（3）在Bt毒蛋白的长期选择作用下，种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是：肠道细胞表面受体蛋白的________或________发生变化，导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。
（4）将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种，可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性，原因是________。
5．[2024年安徽高考真题]丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
（1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。
（2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。
、
（3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g·L-1和15 g·L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g·L-1、100 g·L-1、110 g·L-1）和酵母粉（12 g·L-1、15g·L-1、18 g·L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置______（填数字）组实验（重复组不计算在内）。
（4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__________________。
（5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经_____________________，最终获得发酵产品。
6．[2024年甘肃高考真题]源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选茵株X、能起到筛选作用的原因是_______。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_______。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是_______。
（3）过程⑤在基因工程中称为_______该过程需要的主要酶有_______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有_______。该过程用Ca2+处理细胞、使其处于一种_______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是_______（答出两点）。
7．[2024年河北高考真题]新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。
（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
8．[2024年山东高考真题]研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越_________（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_________种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_________-3'和5'-_________-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_________，其中纯合的突变植株是_________（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
9．[2023届·河北·模拟考试]单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠一人嵌合抗体，主要流程如下图所示。回答下列有关问题：
（1）获取VL，基因和VH基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取_____，再通过反转录法来合成。图中的Sp2/0细胞最可能是______细胞。
（2）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的__端加上特定的限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_________________。
（3）上述基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和________（答出两个即可），其中启动子的作用是_______________。
10．[2024届·广东·一模]Ⅲ型胶原蛋白，是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白。Ⅲ型胶原蛋白不仅是许多器官必不可少的结构成分，还可通过与血小板结合而促进血小板聚集，因此在凝血中起重要作用。家蚕丝腺生物反应器是利用家蚕丝腺表达重组蛋白的转基因动物表达系统。家蚕已丧失飞翔逃逸能力，家蚕幼虫丝腺具有强大的蛋白质合成与分泌能力。科学家已成功利用家蚕丝腺生物反应器生产Ⅲ型胶原蛋白，回答以下问题：
（1）科学家将Ⅲ型胶原蛋白基因与_______等调控元件重组在一起，通过_____________的方法导入家蚕的受精卵。
（2）从转基因产品的安全性角度分析，家蚕作为外源基因的受体，安全性较高，是因为_______。
（3）科学家曾用大肠杆菌作为工程菌生产Ⅲ型胶原蛋白，流程如图所示：
①选取的皮肤细胞为生命力旺盛的新生细胞，原因是_______。
②要将成功转入Ⅲ型胶原蛋白基因的工程菌筛选出来，所用的方法是在培养基中添加_______。
（4）对比工程菌大肠杆菌，利用家蚕丝腺生物反应器生产Ⅲ型胶原蛋白的优势在于_______，因而使Ⅲ型胶原蛋白具有生物活性。
11．[2024届·山东·模拟考试联考]基因编辑是一种新兴的较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行改造的一种基因工程技术。CRISPR/Cas9 系统可对基因组进行定点编辑，其工作原理如图1所示。人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，可从血浆中制备，也可以通过基因工程的方法制备。图2 表示以基因工程技术获取重组 HSA（rHSA）的两条途径。请回答下列问题：
（1）分析图1可知，Cas9 蛋白在功能上类似子_________酶。实验发现sgRNA 的序列长短影响成功率，CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时存在“脱靶”风险，原因可能是_______。
（2）图2中，与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA 的优势是__________。
（3）图2的途径1中，借助农杆菌将 HSA 基因导入水稻受体细胞的过程中，利用了农杆菌细胞______________的特点。途径Ⅱ中将 HSA 基因导入大肠杆菌细胞时，需对大肠杆菌细胞进行的处理及目的是______________。
（4）下图3 为获取的含有目的基因（HSA 基因）的 DAA片段，Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图4是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图5 是农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。
基因工程操作程序中的核心工作是______________分析图3~图5，为将 HSA基因定向插入图5所示的载体中并进行准确连接，需要用到的酶有_______________。
12．[2024届·湖北·模拟考试]利用RNAi技术（RNA干扰）可以抑制细胞内特定基因表达。研究者选择MS26基因中的一段序列（rMS26），以PMI作为筛选标记，最终构建玉米植物重组表达载体MS26RNAi，转入到玉米幼胚中，通过植物组织培养后获得目的植株。
（注：PMI是酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因，该酶能将6—磷酸甘露糖转化为6—磷酸果糖，从而使生物体能够利用甘露糖作为碳源）
请分析回答以下问题：
图1
（1）提取玉米MS26基因形成的RNA，使用______法合成cDNA，选择其中的一段序列rMS26用于构建RNAi载体。
（2）常用的标记基因主要是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，已经引起了社会的广泛争议。用PMI做标记基因的目的是为了______，可转入含______的选择培养基中实现，其优点是__________________。
（3）RNAi载体结构中有一段正向和反向的rMS26，其直接目的是：______，请据图1分析MS26基因沉默的原理：________________________。
（4）T-DNA插入玉米的位置是随机的，当其插入基因内部时导致______，这是获得植物突变体的一种重要方法。若进一步确定T-DNA是否插入MS26基因中，某同学尝试采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图2所示。（说明：两端的引物本身长度小于0.1kb，而T-DNA本身的长度约为17kb，插入基因后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。）
请根据下表中三种样品的预期电泳结果判断哪个是纯合突变体______，理由是__________________。
图2
引物种类 样品序号 LP+RP BP+RP
样品1 有大片段 无
样品2 有大片段 有小片段
样品3 无 有小片段
参考答案
1．答案：D
解析：用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步，A正确；构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2+处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确；抗原-抗体杂交法可检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞，D错误。
2．答案：（1）植物细胞培养；不占用土地；不受季节、天气等的限制
（2）叶绿体有双层膜结构，蛋白质产物分离（提取）不易；叶绿体中只有核糖体，没有内质网和高尔基体，蛋白质没有经过正确加工（没有活性）
（3）①启动子和终止子；所用启动子只在水稻胚乳细胞中启动转录过程
②农杆菌转化法；不能；细胞匀浆中有DNA，其中的目的基因会对检测造成干扰；也可能有RNA酶能将待测RNA水解掉而检测不到
解析：（1）悬浮细胞生物反应器的原理是细胞增殖，用到细胞工程中的植物细胞培养技术，该技术的主要优点有不占用土地；不受季节、天气等的限制。
（2）叶绿体生物反应器可能存在的缺点是叶绿体有双层膜结构，蛋白质产物分离（提取）不易；叶绿体中只有核糖体，没有内质网和高尔基体，蛋白质没有经过正确加工（没有活性）。
（3）①重组载体中HN基因能正常表达，必须正确连接到启动子和终止子序列之间。为保证HN基因只在水稻胚乳细胞中正确表达，需要所用启动子只在水稻胚乳细胞中启动转录过程。②利用农杆菌转化法，将重组载体转入水稻愈伤组织。细胞匀浆中有DNA，其中的目的基因会对检测造成干扰；也可能有RNA酶能将待测RNA水解掉而检测不到，所以不能用PCR方法证明HN基因在水稻胚乳中已经转录。
3．答案：（1）限制性内切核酸酶（限制酶）；DNA连接酶
（2）聚合酶链式（PCR）；2种引物；4种脱氧核糖核苷酸（4种dNTP）；DNA聚合酶需要Mg2+激活；琼脂糖凝胶电泳
（3）照射红光（660nm）和照射远红光（730nm）；控制照射红光（660nm）的时长（或照射红光（660nm）后和再照射远红光（730nm）的时长间隔）
解析：（1）融合蛋白是由两个或多个不同蛋白质连接而成的单一多肽链。为了实现融合蛋白在细胞内的表达，需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶这两种工具酶，将两种蛋白质的基因拼接在一起。
（2）聚合酶链式反应（PCR技术）可用于扩增融合后的目的基因。该反应需要在一定的缓冲液中进行，其中需要提供目的基因、两种引物、四种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。Mg2+是激活DNA聚合酶所必需的，因此需要在缓冲液中添加。扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。
（3）研究人员将PhyA-FHY1的转录激活系统与小鼠胰岛素基因相关联后，培育出小鼠工程化细胞。这些细胞移植至小鼠皮下后，可以通过照射红光（660nm）开启细胞内胰岛素基因的表达，通过照射远红光（730nm）的方式关闭细胞内胰岛素基因的表达。同时，通过控制照射红光（660nm）的时长或照射红光（660nm）后和再照射远红光（730nm）的时长间隔，控制胰岛素的生成量。
4．答案：（1）细胞坏死
（2）分化；通过某种方法使转基因棉花表达某物质，以抑制肠干细胞的激活（3）空间结构；数量
（4）为敏感棉铃虫提供正常的取食环境，使敏感棉铃虫始终保持一定的数量，敏感棉铃虫和抗性棉铃虫存在种内竞争，使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
解析：（1）Bt毒蛋白通过直接破坏细胞结构（细胞膜），导致细胞死亡，属于细胞坏死。
（2）细胞分裂可以增加细胞的数目，细胞分化可以使细胞结构和功能发生变化。肠干细胞可通过细胞分裂和细胞分化产生新的肠道细胞。可通过某种方法使转基因棉花表达某物质，以抑制肠干细胞的激活，从而使棉铃虫死亡。
（3）相关受体蛋白的空间结构发生改变或数量减少都会使Bt毒蛋白与相应受体结合的概率降低，导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。
（4）将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种，可为敏感棉铃虫提供正常的取食环境，敏感棉铃虫始终保持一定的数量，即使部分棉铃虫对转基因抗虫棉产生了抗性，一方面因其与敏感棉铃虫交配，使具备抗性的棉铃虫种群数量不会迅速增加；另一方面，由于具备抗性的棉铃虫与敏感棉铃虫之间存在种内竞争，可以使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓。
5．答案：（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
（2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
（3）乳酸或有机酸；9
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
（5）提取、分离、纯化
解析：（1）在PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）
大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
6．答案：（1）允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长；产生纤维素酶分解能力大小（产生纤维素酶的多少）
（2）TaqDNA聚合酶
（3）表达载体的构建；限制性内切核酸酶和DNA连接酶
（4）大肠杆菌繁殖迅速、结构简单、操作较容易；能吸收周围环境中DNA分子
（5）纤维素的结构与组分不同（生物质原料不同）、三种酶混合物比例不同
解析：（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
（2）扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
（3）根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。
（4）大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
（5）不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。
7．答案：（1）在胚乳中特异性表达的基因；使转录在所需要的地方停下来；HindⅢ；EcoRⅠ
（2）农杆菌转化；是否转录出mRNA；抗原一抗体杂交
（3）1/4；纯合体自交后代不发生性状分离
（4）体液；细胞
（5）水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗（合理即可）
解析：（1）若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnI的识别序列，而SacI的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoRI对r2HN和载体进行切割。
（2）通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达，可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白。
（3）设r2HN为基因N，则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN：Nn：nn=1：2：1，r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。
（4）抗体参与体液免疫，CD8+T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析图形，实验组的抗体水平及CD8+T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中大量获得疫苗。
8．答案：（1）低；44；GTTT；CAAT
（2）卡那霉素；SacⅠ；④
（3）1/4
解析：（1）引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导致非特异性产物的形成，影响PCR的特异性和准确性。
（2）分析载体信息可知，卡那霉素抗性基因位于T-DNA上，故重组载体中含有卡那霉素抗性基因，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素卡那霉素可筛选到具有该抗生素抗性的植株。
（3）设基因L突变为基因L'，则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L'，由题中信息知，一条染色体插入了T-DNA，若其插入了L'所在染色体，其所在染色体记为L'1，则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1，：L'1L'：L'L'=1：2：1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代，筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株（L'L'）所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体，所得结果相同。
9．答案：（1）mRNA；骨髓瘤
（2）5’；使DNA片段能定向插入表达载体
（3）标记基因、终止子、复制原点；RNA聚合酶识别和结合的部位
解析：（1）获取VL基因和VH基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取mRNA，再通过反转录法来合成。图中的Sp2/0细胞最可能是骨髓瘤细胞。
（2）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的5’端加上特定的限制性酶切位点，为了使DNA片段能定向插入表达载体，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（3）基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和标记基因、终止子、复制原点，其中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。
10．答案：（1）家蚕丝腺细胞中特异性表达的基因的启动子；显微注射
（2）家蚕已丧失飞翔逃逸能力，作为家养的动物，对人类无害
（3）新生的皮肤细胞Ⅲ型胶原蛋白合成旺盛；四环素
（4）家蚕丝腺细胞中有内质网和高尔基体，能对Ⅲ型胶原蛋白进行加工
解析：（1）结合题意可知，科学家将Ⅲ型胶原蛋白基因与家蚕丝腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入家蚕的受精卵，进而获得转基因家蚕。
（2）从转基因产品的安全性角度分析，家蚕作为外源基因的受体，安全性较高，是因为家蚕作为家养的动物，对人类无害，且具有生活周期短、易饲养的特点。
（3）①本实验中选取的皮肤细胞为生命力旺盛的新生细胞，一方面是因为Ⅲ型胶原蛋白是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白，即型胶原蛋白在人体皮肤细胞中表达，另一方面皮肤细胞更新快。②要将成功转入Ⅲ型胶原蛋白基因的工程菌筛选出来，需要借助标记基因进行筛选，根据图示可知，重组质粒中带有四环素抗性基因，因此，可在培养基中添加四环素进行筛选。
（4）对比工程菌大肠杆菌，利用家蚕丝腺生物反应器生产Ⅲ型胶原蛋白的优势在于家蚕丝腺生物反应器中含有内质网和高尔基体，能对Ⅲ型胶原蛋白进行加工，因而使Ⅲ型胶原蛋白具有生物活性。
11．答案：（1）限制（性内切核酸）：sgRNA序列较短，特异性差
（2）水稻是真核生物，具有内质网、高尔基体，能对初始HSA多肽进行加工，产生有活性的rHSA
（3）含有Ti质粒，当它侵染水稻细胞时，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上；用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于将重组的基因表达载体导入其中
（4）基因表达载体的构建：EcoRI，BamH I和Sau3AI，以及DNA连接酶
解析：（1）分析图1可知，Cas9蛋白在功能上类似于限制酶，可将DNA剪成不同的片段。sgRNA的序列长短影响成功率，CRISPR/Cs9基因编辑技术有时存在“脱靶”风险：原因可能是sgRNA序列较短，特异性差。
（2）人体合成的初始HSA多肽，需要经过进一步盘曲，折叠，形成特定空间结构才有活性，而大肠杆菌为原核生物，不具有内质网，高尔基体。故与途径Ⅱ相比，选择途径I获取HSA的优势是水稻是真核生物，具有内质网，高尔基体，能对初始HSA多肽进行高效加工，产生有活性的rHSA。
（3）图2的途径I中，借助农杆菌将HSA基因导入水稻受体细胞的过程中，利用了农杆菌细胞含有Ti质粒，当它侵染水稻细胞时，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中。并且将其整合到该细胞的染色体DNA上的特点。途径Ⅱ中将HSA基因导入大肠杆菌细胞时，常用Ca2+处理4大肠杆菌细胞。使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于将重组的基因表达载体导入其中。
（4）基因工程操作程序中的核心工作是基因表达载体的构建。分析图3~图5，为将HSA基因定向插入图5所示的载体中，应选用EcoR I和BamH I酶切割目的基因。以产生不同的黏性末端，并用EcoR I和Sa3AI与限制酶BamH I产生的黏性末端互补连接切制质粒，然后用DNA连接酶进行连接构建。
12．答案：
（1）反转录（或逆转录）
（2）筛选出重组表达载体导入成功的植物细胞；露糖；获得的转基因植物不含抗生素抗性基因或除草剂抗性基因，因而对人体和环境安全
（3）使RNAi载体导入进行表达时能形成RNA双链；RNA双链被D酶切割后形成SiRNA，SiRNA与MS26基因转录形成的mRNA发生部分配对，引起MS26基因转录形成的mRNA降解，从而使MS26基因无法表达（翻译）
（4）基因突变；样品3
据表可知，若T-DNA插入植物体MS26基因中，则会有BP与RP扩增形成小片段，样品3仅有小片段，故样品3为纯合突变体
解析：（1）利用RNA通过逆转录合成DNA
（2）标记基因的功能：便于重组DNA分子的筛选
由题干可知，抗性基因的使用引起社会的广泛争议，导入PMI使植物细胞可以利用甘露糖，通过构建以甘露糖为唯一碳源的培养基，可以筛选导入重组表达载体的细胞。结合题干，抗性基因的使用引起社会的广泛争议，PMI基因的使用则不会带来这样的问题。获得的转基因植物不含抗生素抗性基因或除草剂抗性基因，因而对人体和环境安全
（3）体内基因的表达只会有一条链表达，故正向与反向的rMS26基因会表达出两条互补的RNA链。据图可知，正向和反向的rMS26基因表达产物会形成RNA双链，经修饰后，RNA双链被D酶切割后形成SiRNA，形成的小干扰RNA与MS26基因转录形成的mRNA部分配对，从而引起MS26基因转录形成的mRNA发生降解，MS26基因无法表达（翻译）。
（4）T—DNA插入玉米的基因，造成碱基的增添，属于基因突变
据表可知，若T-DNA插入植物体MS26基因中，则会有BP与RP扩增形成小片段，样品3仅有小片段，故样品3为纯合突变体。